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Borrelien-ELISPOT Die Borrelien-EliSpot Forschung und Kitentwicklung der Firmengruppe AID GmbH wird im Rahmen des Förderprogrammes "Biotechnologie Baden-Würtemberg" unter dem Arbeitstitel "Entwicklung diagnostischer Testverfahren zum Nachweis von durch Zecken übertragener Krankheiten" vom Land Baden Würtemberg finanziell unterstützt und mitgetragen. Erste Ergebnisse können Sie in der Vorabveröffentlichung "Häufigkeit und mögliche klinische Relevanz von Koinfektionen mit Borrelien und Anaplasma" einsehen. Häufig gestellte Fragen (FAQ) zu EliSpot und Borrelien:
Was genau ist der Unterschied zum LTT? Worin liegen die Vorteile des EliSpots gegenüber dem LTT? Obwohl beiden Tests grundsätzlich die Analytik der T-Zellen zugrunde liegt, unterscheiden sich beide Methoden erheblich. Der LTT (=Lymphozyten-Transformations-Test) misst relativ unspezifisch das Wachstum (Proliferation) von Lymphozyten (B- und T-Lymphozyten) nach Antigen Stimulation und ist somit korrekterweise eher als LPT (Lymphozyten-Proliferations-Test) zu bezeichnen, da eine Transformation (Zellveränderung) im eigentlichen Sinn nicht gemessen werden kann.
Abb: EliSpot und simulierter LTT (72h-EliSpot). Der klinisch unauffällige Proband zeigt nach 72 Stunden Inkubationszeit eine deutlich positive Reaktion (rechtes Bild) Ist EliSpot gleichbedeutend mit ELISA? Beide Tests arbeiten methodisch recht ähnlich. Während der Borrelien ELISA allerdings Antikörper der Klassen IgG und IgM erfaßt weist der EliSpot die spezifische Zytokinabgabe von THelfer-Zellen nach. Der Elispot ist darüberhinaus sehr viel sensitiver (bis zu 200x) und spezifischer als der ELISA. Ist ein EliSpot bei positiver Borrelien-Serologie notwendig? Sollte ein EliSpot bei Verdacht auf eine Borrelieninfektion immer durchgeführt werden?
Zeigen sowohl ein ELISA als auch ein Immunoblot eine Borrelieninfektion an, ist eine zusätzlich Untersuchung mittels Elispot nicht notwendig. Die Infektion wurde eindeutig nachgewiesen und würde vom EliSpot nur weiter bestätigt werden.
Kann EliSpot eine Antibiotika-Therapie überwachen? Ja. dies ist möglich. EliSpot ist die einzig bislang entwickelte Methode die es erlaubt anhand der gemessenen Anzahl von THelfer- Zellen den Verlauf der Antibiotika-therapie darzustellen. Dies ist bei der Betrachtung von Antikörpern, wie sie im ELISA und im Immunoblot durchgeführt wird, nicht möglich. Ab wann kann eine EliSpot Diagnose durchgeführt werden? THelfer- Zellen spielen bei der Aktivierung von antigenspezifischen B-Zellen eine wichtige Rolle und sind daher nach einer Infektion zeitlich früher nachweisbar als B-Zellen. Während bis zur Produktion der ersten Antikörper mindestens 14 Tage Zeit vergehen, sind spezifische T-Zellen bereits wenige Tage nach der Infektion messbar. Daher kann der EliSpot-Assay eine vorhandene Infektion entscheidend früher bestimmen, wodurch ein früherer Einsatz entsprechender therapeutischer Maßnahmen ermöglicht wird. Werden mit EliSpot auch andere Diagnosen durchgeführt? Der Elispot hat vor etwa 5 Jahren Einzug in die medizinische Diagnostik gehalten. Aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität wird der Elispot weltweit bei der Tuberkulose Diagnostik eingesetzt. In anderen Bereichen wie der Transplantationsmedizin und der Impfstoffentwicklung (z.B. HIV, Malaria etc.) wird der Elispot schon seit mehreren Jahren erfolgreich angewandt. Wo kann ich einen EliSpot machen lassen? Welche Labore bieten EliSpot an? EliSpot wird inzwischen in vielen Laboren in Deutschland angeboten. Gerne können Sie uns kontaktieren. Wir nennen Ihnen ein Labor in Ihrer Nähe. Schauen Sie sich die kleine Animation an, indem Sie diesem Link folgen: EliSpot - wie funktioniert das?
Der ELISPOT-Test rückt zunehmend mehr ins Blickfeld bei der Diagnose von Borreliosen. Da wir uns seit Jahren mit der Entwicklung von ELISPOT-Testmethoden und der Diagnose von Infektionen, Allergien, Autoimmunerkrankungen und Transplantationen beschäftigen, fühlen wir uns in der Lage die Möglichkeiten des Elispots in der Routinediagnostik kritisch zu diskutieren.
Allgemeiner Hintergrund Die Lyme-Borreliose ist eine Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Borrelia burgdorferi ausgelöst wird. Da sich die Borrelien über das Blut im gesamten Organismus ausbreiten können und dabei viele Gewebe und Organe in Mitleidenschaft ziehen, spricht man hier auch von einer Multisystemerkrankung. Durch einen Zeckenbiss auf den Menschen übertragene Borrelien können die Eigenschaft haben, sich dem Immunsystem zu entziehen und somit zunächst unerkannt im Körper zu verbleiben. Dies führt dazu, dass Immunreaktionen, wie die Bildung von Antikörpern gegen die Borrelien, meist erst sehr spät nachzuweisen sind. So ist zum Beispiel bekannt, dass in der Frühphase bei nur 20-50% der Borrelien-infizierten Personen Antikörper detektiert werden können. Daher ist auch unklar, ob Borrelien-Infektionen möglicherweise häufig unerkannt verlaufen. Eine klare Diagnose ist deshalb vielfach sehr schwierig zu stellen. Nun stellt sich die Frage, ob die derzeitigen Untersuchungsmethoden ausreichend sind oder ob alternative Testmethoden bei unklaren Diagnosen sinnvoll einzusetzen wären. Unserer Meinung nach wäre es sinnvoll die zentrale Schaltstelle einer Abwehrreaktion genauer zu durchleuchten. Dies ist bei jeder Infektion die so genannte T-Helfer Zelle. T-Helfer Zellen haben die Aufgabe alle Abwehrreaktionen im Körper zu steuern und sind somit auch verantwortlich für die Produktion von Antikörpern. Deshalb gilt auch der Grundsatz: „Ohne T-Zellen gibt es keine Antikörper.“ Ebenso wie spezifische Antikörper gibt es auch spezifische T-Zellen gegen Infektionserreger wie Borrelien. Ein entscheidender Unterschied ist jedoch, dass diese spezifischen T-Zellen lange vor den Antikörpern nachweisbar sind. Auch können T-Zellen auftreten ohne dass eine nachweisbare Antikörperproduktion stattfindet. Der ELISPOT ist eine der sensitivsten Methoden diese spezifischen T-Zellen zu detektieren. Eines der Gebiete, wo der Elispot bereits eingesetzt wird, ist die Tuberkulose-Diagnostik. Auch in weiteren Bereichen der Infektionserkrankungen wie bei Hepatitis und Transplantationen ist der ELISPOT etabliert. In der Impfstoffentwicklung ist die Messung der Immunreaktion mit Hilfe des ELISPOTs Standard und gilt im Bereich der HIV-Impfstoffentwicklung sogar inzwischen als „Goldstandard“.
Die ELISPOT-Methode Der ELISPOT (Enzym-linked immunospot) ist eine Methode zum Nachweis von spezifischer bzw. erregerspezifischer zellulärer Immunität. D.h. mit Hilfe des ELISPOTs weist man Zellen nach, die aufgrund einer Immunreaktion, z.B. durch eine Infektion im Organismus, aktiviert werden. (Ausführliche Informationen zum Immunsystem finden Sie unter http://de.wikipedia.org/wiki/Immunabwehr)
Der ELISPOT ist einfach durchzuführen und ähnelt im Wesentlichen der Abarbeitung eines Elisas. Wichtige Unterschiede sind jedoch die vor geschaltete Isolation der T-Lymphozyten und eine Inkubationszeit von etwa 16 Stunden (über Nacht) zur Aktivierung der T-Zellen. Da der ELISPOT die Ausschüttung von Botenstoffen, so genannter Cytokine, einzelner aktivierter T-Zellen messen kann, gilt er als sehr sensitiv und hoch spezifisch. Mit Hilfe der Cytokine steuert die T-Zelle das gesamte Immunsystem.
Vergleich mit anderen Methoden
Borrelien und ELISPOT Da nur etwa 20-50 % der Borrelien positiven Patienten in der frühen Phase mit den herkömmlichen Nachweisverfahren erkannt werden, besteht im Hinblick auf die Spätfolgen ein dringender Handlungsbedarf für die Entwicklung und Etablierung neuer sensitiver und spezifischer Methoden zum Nachweis einer Borreliose. Hier stellt der ELISPOT eine Methode dar, die dies leisten kann. So ist es mit dem Borrelien ELISPOT prinzipiell möglich alle durch Borrelien spezifisch aktivierten T-Zellen zu erfassen. Diese Borrelien-spezifischen T-Zellen können sehr früh, nämlich bereits 3 Tage nach einem Zeckenbiss, im Blut des Betroffenen vorhanden sein. Hingegen sind Antikörper (IgG) gegen Borrelien nach Erstinfektion oft erst nach einigen Wochen messbar. Im Folgenden sind erste Daten aufgeführt, die den Einsatz des ELISPOTs in der Borrelien-Diagnostik untersuchten. Nachweis einer Borreliose Erste Studienergebnisse von Professor Harrer vom Institut für Immunologie der Universität Erlangen zeigen, dass bei Patienten mit einem definierten Erythema chronicum migrans (ECM) der ELISA nur 45% positive erfasste, im Gegensatz zum ELISPOT, der 75% detektierte.
Abb. 4: Vergleich der Sensitivität zwischen Elisa und ELISPOT bei klinisch positiven Borreliosen oder Patienten mit einem Erythema chronicum migrans (ECM). Hier möchten wir ausdrücklich darauf hinweisen, dass der ELISPOT nicht zum Screenen auf Borrelien genutzt werden soll, sondern vielmehr als alternativer Test bei unklaren serologischen Befunden oder zur Therapieüberwachung dient.
Therapieüberwachung In derselben Studie von Professor Harrer konnte gezeigt werden, dass während einer erfolgreichen Therapie mit Antibiotika die Anzahl der Borrelien-spezifischen T-Zellen eindeutig abnimmt. Dies könnte sehr hilfreich sein, da bei chronischen Borreliosen trotz einem Ansprechen der Therapie eine Linderung der Symptome nicht unmittelbar erkennbar ist. Auch Borrelien-spezifische Antikörper bleiben in der Regel über Monate bis Jahre nachweisbar und eignen sich daher nicht zur Therapieüberwachung bzw. als Erfolgskontrolle bei einer Antibiotikatherapie. Im Gegensatz dazu kann eine Analyse der T-Zellen im Elispot dies sehr wohl leisten. Abb.5: Darstellung von 10 Patienten mit Erythema Migrans und borrelien-spezifischen T-Zellen bei der Erstuntersuchung (graue Balken) und nach der Antibiotikatherapie (schwarze Balken). SFU= Spot Forming Units
Erkennung einer therapieresistenten Lyme Arthritis Groß und Mitarbeiter haben mit Hilfe des ELISPOTs herausgefunden, dass bei der Lyme Arthritis autoreaktive T-Zellen gebildet werden. Diese autoreaktiven Zellen, die sich gegen körpereigene Substanzen richten, reagieren sowohl mit dem Borrelien Antigen OSP A als auch mit einem körpereigenen Protein, das so genannte LFA-1. Durch diese Reaktion hervorgerufene Lymearthritiden werden nur durch Borrelia burgdorferi sensu stricto induziert. Hierbei muss darauf hingewiesen werden, dass auch bei Borrelien positiven Patienten ohne nachweisbare Lyme Arthritis teilweise autoreaktive T-Zellen gefunden werden.
Differenzierung in Borrelien Subtypen mit Hilfe des ELISPOTs Weiterführende Untersuchungen von Steere und Mitarbeitern zur Lyme Arthritis haben gezeigt, dass die Proteinstruktur des OSP A Antigens von entscheidender Bedeutung für die Bildung von autoreaktiven T-Zellen ist. Nur die spezifische Struktur des OSP A Proteins von Borrelia burgdorferi sensu stricto induziert autoreaktive T-Zellen, die mit körpereigenem LFA-1 reagieren. Die OSP A Antigene von Borrelia afzellii und Borrelia garinii weisen eine andere Struktur (bzw. Aminosäuresequenz) auf und führen zur Bildung anderer, nicht autoreaktiver T-Zellen. Dies kann man sich im ELISPOT zu Nutze machen, indem man ohne Erregernachweis nur anhand der gebildeten T-Zellen den spezifischen Erregersubtypen eines Patienten identifizieren kann.
Ausblick Im Vergleich zu anderen Infektionserkrankungen wie Tuberkulose oder Hepatitis C liegen uns bei Borrelien noch recht wenige Daten vor. Um die Anwendungsmöglichkeiten des ELISPOTs bei Borreliose genauer aufzeigen zu können, müssen in jedem Fall weitere Daten generiert werden. Es hat sich gezeigt, dass es zudem auch einiger Erfahrung bei der Interpretation des Versuchsergebnisse Bedarf, um spezifische T-Zell Reaktionen von Artefakten unterscheiden zu können. Darüber hinaus darf man nie vergessen: „Eine Methode ist nur so gut wie derjenige, der sie durchführt und interpretiert.“
Literatur: Ewer K, Deeks J, Alvarez L, Bryant G, Waller S, Andersen P, Monk P, Lalvani A. (2003) Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak. Lancet. 5; 361(9364):1168-73. Forsberg et al. (1995) The outer surface proteins of Lyme disease borrelia spirochetes stimulate T cells to secrete interferon-gamma (INF-g): diagnostic and pathogenic implications. Clin Exp Immunol 1995;101:453-460 Gross DM, Forsthuber T, Tary-Lehmann M et al. (1998) Identification of LFA-1 as a candidate autoantigen in treatment-resistant Lyme-Arthritis. Science 281: 703-706 Kamal et al. (2002) Peginterferon alone or with ribavirin enhances HCV-specific CD4 T-helper 1 responses in patients with chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2002 Oct;123(4):1070-83 Lalvani A, Pathan AA, McShane H, Wilkinson RJ, Latif M, Conlon CP, Pasvol G, Hill AV. (2001) Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med. 163(4):824-8. Lalvani A, Pathan AA, Durkan H, Wilkinson KA, Whelan A, Deeks JJ, Reece WH, Latif M, Pasvol G, Hill AV. (2001) Enhanced contact tracing and spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Lancet. 23;357(9273):2017-21. Mwau, et al. (2002) Design and validation of an enzyme-linked immunospot assay for use in clinical trials of candidate HIV vaccines. AIDS Research and Human Retroviruses 18 (9): 611-618 JUN 10 2002 Pfeiffer, Kalden (2004) "Prospektive Analyse von Borrelien-spezifischen Antikörpern und T-Zellen mittels Interferon-g-ELISPOT an Patienten mit Borrelia burgdorferi Infektion unter antibiotischer Therapie und gesunden Blutspendern." Uni Erlangen Steere et al. (2004) Molecular characterization of the OspA (161-175) T cell epitope associated with treatment-resistant Lyme arthritis: differences among the three pathogenic species of Borrelia burgdorferi sensu lato.
Wilske et al. (2000) MiQ Lyme Borreliosis
Weitere Literatur ist auf Anfrage bei AID erhältlich!
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| AID Borrelien-Diagnostik | ||
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Anti-Borrelia burgdorferi-IgG - Immunoblot |
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Anti-Borrelia burgdorferi-IgM-Immunoblot |
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"Shared Epitope" und Lyme-Arthritis |
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AID
GmbH Ebinger Strasse 4 D-72479 Straßberg |
