HLA-DRB1 Shared epitope
QKRAA/QRRAA/RRRAA

RDB 2035

Das "Shared Epitope" - Ein neuer Rheuma-Wegweiser

Aufbau und Methodik des Hybridisierungskits

• die Identifizierung von Trägern mit einem der Allele DRB1*01 (DR1), DRB1*04 (DR4) oder DRB1*1001 (DR10),
  
  
• eine Differenzierung der DRB1*01 bzw. DRB1*04 Allele in solche mit und solche ohne ein "shared epitope",
  
  
• die Typisierung der "shared epitope"-Sequenzen in QKRAA, QRRAA oder RRRAA,
  
  
• eine Unterscheidung von homozygoten und heterozygoten Trägern
  

Vorgehensweise:

1. Polymerase Kettenreaktion
   
   Mit der DNA einer genomischen DNA-Präparation aus Vollblut werden parallel vier Polymerase Kettenreaktionen (PCR) durchgeführt. Dabei werden, mit den PN-Mixen PN-SE1 bis PN-SE4 die Allele des HLA-DRB1 Gens mit Biotin-markierten Primern selektiv amplifiziert (vgl. Tabelle).
   
   

   PN-Mix	Amplifizierte DRB1-Allele	Amplifizierte Kontrolle
   PN-SE1	DR1	La/SS-B Pseudogen1
   PN-SE2	DR4	Alpha-1-Antitrypsin
   PN-SE3	DR7, 10	La/SS-B Pseudogen1
   PN-SE4	DR3, 8, 9, 11-16	Alpha-1-Antitrypsin

   
   Tabelle: Spezifität der PN-Mixe
   
   Die PCR-Produkte werden anschliessend durch reverse Hybridisierungen an Gensonden auf das Vorhandensein des "shared epitope" hin analysiert. Durch Koamplifikation und Detektion von Positivkontrollen wird in jedem Fall die erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
   
   
2. Erste reverse Hybridisierung
   
   Die PCR-Produkte der Amplifikationen von PN-SE1 und PN-SE2 werden miteinander gemischt und durch reverse Hybridisierung an Gensonden auf das Vorhandensein des "shared epitope" in den Allelen der DRB1*01- und DRB1*04-Gruppe analysiert. Durch Detektion der Positivkontrollen wird auch in DR1 bzw. DR4 negativen Proben die erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
   Bei dieser ersten Hybridisierung können neben allen DRB1*01- und DRB1*04-Shared epitope positiven Merkmalsträgern (DRB1*04-QKRAA, DRB1*04-QRRAA und DRB1*01-QRRAA) auch heterozygote Kombinationen verschiedener DRB1*04 Allele, z.B. DRB1*04-QKRAA und zugleich DRB1*04-QRRAA und darüber hinaus auch alle heterozygoten Kombinationen aus DRB1*01 und DRB1*04 identifiziert werden.
   Um homozygot DRB1*04-QKRAA (bzw. DRB1*04-QRRAA) positive Merkmalsträger, von solchen mit nur einem DRB1*04-"shared epitope"-Allel zu unterscheiden, ist eine zweite Hybridisierung mit einer Mischung der Amplifikate von PN-SE3 und PN-SE4 notwendig (siehe Typisierungsbeispiele; alternativ zur zweiten Hybridisierung können die PCR-Produkte von PN-SE3 und PN-SE4 auch in einer Agarosegelelektrophorese untersucht werden).
   
   
3. Zweite reverse Hybridisierung
   
   Die PCR-Produkte der Amplifikationen von PN-SE3 und PN-SE4 werden miteinander gemischt und an einen weiteren Shared epitope-Streifen hybridisiert. Wiederum wird durch die Detektion der Positivkontrollen auch bei den Proben, die über kein weiteres Nicht-DR1 oder Nicht-DR4 Allel verfügen (die also homozygot sind für z.B. DRB1*04-QKRAA), die erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
   Die zweite Hybridisierung erlaubt eine Unterscheidung zwischen homozygot und heterozygot DR4-"shared epitope" positiven Merkmalsträgern. Darüber hinaus kann das Allel DRB1*1001 mit dem Motiv RRRAA (vgl. klinische Relevanz) identifiziert werden.
   Auch einige der Subtypen aus der DRB1*11- und DRB1*14-Gruppe enthalten das "shared epitope" QKRAA oder QRRAA. Diese Gruppe der Nicht-DRB1*01 bzw. -DRB1*04 "shared epitope" positiven Allele wird ebenfalls detektiert.