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HLA-DRB1
Shared epitope
QKRAA/QRRAA/RRRAA
RDB 2035
Das "Shared Epitope" - Ein neuer Rheuma-Wegweiser
>> Nomenklatur
und klinische Relevanz, Literatur
>> Testauswertung und Beispiele
f�r Typisierung
Aufbau und Methodik,
Vorgehensweise
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Aufbau und Methodik des
Hybridisierungskits
Mit dem "HLA-DRB1 Shared epitope QKRAA/QRRAA/RRRAA" Kit
der Firma AID ist eine zuverl�ssige und rasch durchzuf�hrende Detektion
der Aminos�uremotive QKRAA, QRRAA und RRRAA in der dritten hypervariablen
Region von allen bis dato bekannten HLA-DRB1 Subtypen m�glich. Eine
"low resolution"-Typisierung auf DR1 oder DR4 zu Beginn
der Untersuchung ist nicht n�tig.
Der Kit erm�glicht
- die Identifizierung von Tr�gern mit einem der Allele DRB1*01
(DR1), DRB1*04 (DR4) oder DRB1*1001 (DR10),
- eine Differenzierung der DRB1*01 bzw. DRB1*04 Allele in solche
mit und solche ohne ein "shared epitope",
- die Typisierung der "shared epitope"-Sequenzen in
QKRAA, QRRAA oder RRRAA,
- eine Unterscheidung von homozygoten und heterozygoten Tr�gern
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Vorgehensweise:
- Polymerase Kettenreaktion
Mit der DNA einer genomischen DNA-Pr�paration aus Vollblut werden
parallel vier Polymerase Kettenreaktionen (PCR) durchgef�hrt.
Dabei werden, mit den PN-Mixen PN-SE1 bis PN-SE4 die Allele des
HLA-DRB1 Gens mit Biotin-markierten Primern selektiv amplifiziert
(vgl. Tabelle).
| PN-Mix |
Amplifizierte DRB1-Allele |
Amplifizierte Kontrolle |
| PN-SE1 |
DR1 |
La/SS-B Pseudogen1 |
| PN-SE2 |
DR4 |
Alpha-1-Antitrypsin |
| PN-SE3 |
DR7, 10 |
La/SS-B Pseudogen1 |
| PN-SE4 |
DR3, 8, 9, 11-16 |
Alpha-1-Antitrypsin |
Tabelle: Spezifit�t der PN-Mixe
Die PCR-Produkte werden anschlie�end durch reverse Hybridisierungen
an Gensonden auf das Vorhandensein des "shared epitope"
hin analysiert. Durch Koamplifikation und Detektion von Positivkontrollen
wird in jedem Fall die erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
- Erste reverse Hybridisierung
Die PCR-Produkte der Amplifikationen von PN-SE1 und PN-SE2 werden
miteinander gemischt und durch reverse Hybridisierung an Gensonden
auf das Vorhandensein des "shared epitope" in den Allelen
der DRB1*01- und DRB1*04-Gruppe analysiert. Durch Detektion der
Positivkontrollen wird auch in DR1 bzw. DR4 negativen Proben die
erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
Bei dieser ersten Hybridisierung k�nnen neben allen DRB1*01- und
DRB1*04-Shared epitope positiven Merkmalstr�gern (DRB1*04-QKRAA,
DRB1*04-QRRAA und DRB1*01-QRRAA) auch heterozygote Kombinationen
verschiedener DRB1*04 Allele, z.B. DRB1*04-QKRAA und zugleich
DRB1*04-QRRAA und dar�ber hinaus auch alle heterozygoten Kombinationen
aus DRB1*01 und DRB1*04 identifiziert werden.
Um homozygot DRB1*04-QKRAA (bzw. DRB1*04-QRRAA) positive Merkmalstr�ger,
von solchen mit nur einem DRB1*04-"shared epitope"-Allel
zu unterscheiden, ist eine zweite Hybridisierung mit einer Mischung
der Amplifikate von PN-SE3 und PN-SE4 notwendig (siehe Typisierungsbeispiele;
alternativ zur zweiten Hybridisierung k�nnen die PCR-Produkte
von PN-SE3 und PN-SE4 auch in einer Agarosegelelektrophorese untersucht
werden).
- Zweite reverse Hybridisierung
Die PCR-Produkte der Amplifikationen von PN-SE3 und PN-SE4 werden
miteinander gemischt und an einen weiteren Shared epitope-Streifen
hybridisiert. Wiederum wird durch die Detektion der Positivkontrollen
auch bei den Proben, die �ber kein weiteres Nicht-DR1 oder Nicht-DR4
Allel verf�gen (die also homozygot sind f�r z.B. DRB1*04-QKRAA),
die erfolgreiche DNA-Isolierung und PCR dokumentiert.
Die zweite Hybridisierung erlaubt eine Unterscheidung zwischen
homozygot und heterozygot DR4-"shared epitope" positiven
Merkmalstr�gern. Dar�ber hinaus kann das Allel DRB1*1001 mit dem
Motiv RRRAA (vgl. klinische Relevanz) identifiziert werden.
Auch einige der Subtypen aus der DRB1*11- und DRB1*14-Gruppe enthalten
das "shared epitope" QKRAA oder QRRAA. Diese Gruppe
der Nicht-DRB1*01 bzw. -DRB1*04 "shared epitope" positiven
Allele wird ebenfalls detektiert.
>> Nomenklatur
und klinische Relevanz, Literatur
>> Testauswertung und Beispiele
f�r Typisierung
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